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β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性檢測試劑盒說明書
點擊次數:34 更新時間:2024-03-26

β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性檢測試劑盒說明書


注意:正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

貨號:100T/48S

產品內容:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。




微量法


試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入 2.5mL 雙蒸水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二:液體 4mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。

標準液:液體 1mL×1 支,4℃保存,5μmol/mL 對硝基苯酚溶液。

產品說明:

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解,此外還具有轉半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量,還能在正常的多糖代謝、細胞壁組分代謝以及衰老時細胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解,釋放自由的半乳糖。

β-GAL 分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL 活性。

試驗中所需的儀器和試劑:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟:

一、粗酶液提?。?/span>

1、細菌或培養細胞的處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復30 次),15000g,4℃,離心 20 分鐘,取上清,置冰上待測。

2、組織的處理:稱取約 0.2g 組織,加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿;15000g,4℃,離心 20 分鐘, 取上清,置冰上待測。

3、標準液的處理:用蒸餾水將標準液稀釋至 200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL.

二、測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 400nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定,(在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑):


試劑名稱(μL)測定管對照管標準管

試劑一25

蒸餾水25

試劑二3535

樣本1010

迅速混勻,放入 37℃保溫 30min

標準液70

試劑三130130130

充分混勻, 400nm 處測定吸光值 A,計算ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設一個對照管。三、β-GAL 活性計算:

根據標準管的吸光度(x,減去濃度為 0 的標準管 OD 值)和濃度(y,nmol/mL)建立標準曲線,將△A 帶入標準曲線中,計算樣品生成的產物量(nmol/mL)。

1.按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時產生 1nmol  對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=14×y÷Cpr 需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

2.按樣本鮮重計算:

單位的定義:每 g  組織每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /g 鮮重)=(y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=14×y ÷W

3.按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每 1  萬個細菌或細胞每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /104 cell)= (y×V 反總)÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.028×y

Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V 反總:反應體系總體積,0.07mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數, 500 萬;T:反應時間,0.5h。

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實驗技術服務:

 


滬公網安備 31011802001676號

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